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目次
細胞表面の目的タンパク質の新たなラベリング法- “Easy ID” –
蛍光標識試薬 “Easy ID”の仕組み
AGD化学 (Affinity-Guided DMAP chemistry)によるラベリングの画期性
リガンドに*DMAPを連結したリガンド連結DMAPを触媒として**アシルドナー (チオエステル誘導体－蛍光色素修飾)を目的タンパク質に結合させるラベル化法です。レセプターに対するリガンド、抗原に対する抗体 (VHH、scFv、Fab)に代わって蛍光修飾された小さな分子が共有結合します。
“Analysis of Cell-surface Receptor Dynamics Through Covalent Labeling by Catalyst-tethered Antibody“†
Takahiro Hayashi, Yuki Yasueda, Tomonori Tamura, Yousuke Takaoka, Itaru Hamachi*
J. Am. Chem. Soc., 137, 5372–5380 (2015)
本製品 “Easy ID” のパッケージ内容
- 標準プロトコール5回分: 39,000円(税別)
Easy ID プロトコル
◆マレイミドDMAP修飾プロトコル
- 目的タンパク質、抗体などをPBSなどの適切なバッファー (pH7~8推奨)に溶解する。
最終的に50 μM, 300 μlのタンパク質溶液①を作る。
(実際実験のスケールによってタンパク質溶液は50μl -500μlも可) - 本試薬に100 μl DMSOを添加し5 mMの試薬ストック②を作る。
(一つの瓶で50 μlか100 μl DMSOを添加して、5 mMのストックを作られるほうがよいでしょう) - 上記①のタンパク質に対し、等モルの試薬 (上記DMSOストック溶液②)3 μlを加え、ピペッテングにより反応溶液をよく混ぜる。
- 室温で30分-60分インキュベートする。
(MALDI MSで反応を追跡するのがよい。反応が100%進行しない場合、試薬ストックを1～2当量追加) - ゲルろ過などにより修飾されたタンパク質を精製する。
当プロトコルでのポイント
細胞抗原ラベリング時は、上記にて調製したタンパク質(抗体)-DMAPコンジュゲートを最終濃度 1 μMになるようにする。
また、Acyl donorを最終濃度 8 μMになるように細胞 (培地中)に添加する。(Hayashi et al., JACS (2015) 参照)
注意1) 修飾反応が進行しない場合、DTTやTCEPにより目的タンパク質を還元することを推奨。還元後、余剰の還元剤を除くこと。
注意2) フリーシステインの再酸化を防ぐため、窒素雰囲気下でのインキュベートを推奨。
◆マレイミドDMAP修飾プロトコル (還元バージョン)
- 目的タンパク質、抗体などをPBSなどの適切なバッファー (pH7~8推奨)に溶解する。
最終的に50 μM, 300 μlのタンパク質溶液を作る。
(実際実験のスケールによってタンパク質溶液は50ul-500ulも可) - タンパク質に対し2～5当量のDTTやTCEPを添加する。
(タンパク質と同じバッファーで5 mMの還元剤溶液を使えばよい) - 4℃で1時間静置インキュベートする。
- DTTの場合スピンカラムで余分のDTTを除く。
(TCEPの場合次のステップへ) - 本試薬に100 μl DMSOを添加し5 mMの試薬ストック②を作る。
(一つの瓶で50 μlか100 μl DMSOを添加いて、5 mMのストックを作られるほうがよいでしょう) - 上記還元されたタンパク質に対し等モルの試薬(上記DMSOストック溶液②)3μlを加え、ピペッテングにより反応溶液をよく混ぜる。
- 室温で30分-60分インキュベートする。
(MALDI MSで反応を追跡するのがよい。反応が100%進行しない場合、試薬ストックを1～2当量追加添加) - ゲルろ過などにより修飾されたタンパク質を精製する。
注意) フリーシステインの再酸化を防ぐため、窒素雰囲気下でのインキュベートを推奨。