長鎖RNA転写合成 IVT 受託サービス | 株式会社バイオロジカ

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In Vitro転写による長鎖RNA合成受託サービス概要

ご自分でおやりになりたい方にはこちらのキットをご紹介!!

分子コントロールやCRISPRゲノム編集用に、このページでご紹介する長鎖RNA転写や化学的な長鎖RNA合成が必要な際には、バイオロジカがお届けするBio-Synthesis社などによるサービスでお客様のニーズに合わせたソリューションを提供できます。プラスミド、PCR産物、オリゴヌクレオチドまたはcDNAなどのテンプレートを使用して、化学的に合成されたRNAオリゴヌクレオチドまたはインビトロ転写RNA合成による長いカスタムRNA合成を提供します。同社の長鎖RNA転写合成サービスには、バクテリオファージプロモーター (T7、T3またはSP6など)を含むプラスミドを使用したデザインと遺伝子合成が含まれます。インビトロ転写による長いRNAの合成は、比較的高額であり、収率などが低下しがちで、長さも制限される化学合成RNA (最大200塩基程度)の代替物となります。化学合成とは対照的に、バクテリオファージから得られる長いRNA転写合成は、数千ヌクレオチド長の高品質RNAを産生できます。蛍光標識、末端キャップ修飾または修飾RNA塩基などの各種修飾もまた利用可能です。
同社は、ISO Total Quality Management (TQM)のガイドラインに準拠しております。すべてのカスタム長鎖RNA転写合成は、さまざまな精製オプションを使用して提供されます。同社の品質保証には、挿入されたクローンごとの双方向DNAシーケンシング、電気泳動によるdsDNAとRNAの純度検査、またはリアルタイムPCR、qPCR解析が含まれます。RNA転写産物は、RNaseSAFE™チューブ内で標準化され、パッケージングされて凍結乾燥され、液相中のtrace RNaseを失活させ、運搬中にRNA安定性を得ます。同社の長鎖RNA転写産物は、機能的な遺伝子解析や医学的治療法や診断ニーズの開発に理想的です。

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1. IVT合成受託サービスの特長

未修飾RNA転写物: 生化学アッセイ、構造研究、RNAプローブとしての使用などに適しています。
修飾塩基: 5-Me-CTP、擬似UTPおよび他の修飾NTP
末端キャッピング: m7G(5′)ppp(5′)G (mCAP)、抗リバースキャップアナログ (ARCA)、ポリAまたはポリ(dT)、蛍光色素導入
他の修飾: ポリAまたはポリ(dT)、蛍光色素導入
プロセスの最適化: マルチグラム量までのスケールUP
高品質: オプションのカスタムアッセイの開発と検証による厳しい品質管理
柔軟なソリューション: プラスミド、PCR産物、オリゴヌクレオチドおよびcDNAからの転写産物。標準化・凍結乾燥品

Left: Ambion’s Millennium Marker
Right: mecA RNA product

Bio-Synthesis社は、同社で作製の合成DNAテンプレートまたはお客様から提供されるプラスミドDNAを使用してカスタムRNA転写物を提供します。RNA合成後、2つの精製工程を経ます。まず、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿です。この方法でタンパク質および遊離ヌクレオチドの大部分を除去します。次に、さらに取り込まれていないヌクレオチド、タンパク質、塩を除去するためにスピンカラムクロマトグラフィーを行います。極めて純粋なRNA転写物を必要とするRNase保護アッセイまたはフットプリンティング実験用の標識RNAプローブなどのアプリケーションでは、オプションのサービスとしてゲル精製をお勧めします。

同社のRNA転写サービスは以下の通りです。

2. IVT合成受託サービス仕様

i. 概要 | ii. 各種パッケージ | iii. 精製 | iv. 供給量

◆i. 概要

配列設計
遺伝子合成
サブクローニング
DNA精製および定量
DNAシーケンシング検証
プラスミドの線形化
IVT反応に続いてDNase I処理
RNA精製および定量
RNAサイズチェック (変性PAGEまたはアガロースゲル)
品質保証証明
RNaseSAFE^TMチューブに配合

◆ii. サービスパッケージ

Using SP6 (or T7) polymerases, we can prepare RNA transcripts ranging in size from 50 nts to >5000 nts in length, in quantities from 10 ug to multi-milligram scale.

Standard package:

QC by PAGE or agarose >80%
Guaranteed irrelevant signal is < 1% vs. target (equivalent to 7 Ct difference in qPCR assay)

Silver package:

QC by PAGE or agarose >90%
Guaranteed irrelevant signal contamination < 0.1% vs. target (equivalent to 10 Ct difference in qPCR assay)

Gold package:
In order to prevent cross-contamination between RNAs we provide:

Independent lot-to-lot processing
QC by PAGE or agarose >90%
Guaranteed irrelevant signal contamination < 0.01% vs. target (equivalent to 13 Ct difference in qPCR assay)

Other additional analysis include:

Trace DNA Template analysis by PCR
Template DNA analysis by PCR up to 35 cycles

◆iii. 精製

すべてのRNA転写オリゴはRNaseフリー環境下で精製され、精製方法は以下の通りです。

Column based purification
Lithium chloride precipitation
Spin column chromatography
Phenol extraction followed by alcohol precipitation
Gel Purification optional

◆iv. 合成スケールと収量

収量がμgから数ミリグラムになるようなさまざまな合成スケールを提供します。RNA転写産物の見積もりは、開始時の合成スケールに基づいています。テンプレートによる変動性が高いためです。これらの変動性は、配列、長さ、塩基組成によって影響されます。修飾塩基の取り込みも最終収率に影響を与えます。5-メチル-Cのようないくつかの修飾は最終収率にほとんど影響を与えませんが、2’フルオロ修飾は大きな効果を与えることがあります。以下の表にある、予想RNA転写収量は、1~2キロ塩基です。これらは最終保証量ではありません。

Transcription Scale	RNA Expected Yield (uncapped, no poly(A) tail)	mRNA Expected Yield (capped, poly(A) tailing)	Plasmid DNA Requirements
0.1 ml	0.02 – 0.3 mg	0.01 – 0.1 mg	~15 ug
0.5 mL	0.5 – 1.5 mg	0.25 – 0.75 mg	~50 ug
1.0 ml	1 – 3 mg	0.5 – 1.5 mg	~100 ug
2.0 mL	2 – 6 mg	1 – 3 mg	~200 ug
4.0 mL	4 – 12 mg	2 – 6 mg	~400 ug
6.0 mL	6 – 18 mg	3 – 9 mg	~600 ug
10 mL	10 – 30 mg	5 – 15 mg	~1000 ug

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3. IVT合成受託サービス技術と品質管理

遺伝子構造や機能研究のための超長鎖RNAオリゴヌクレオチドに対する大きな需要がある一方で、従来のRNA合成法を用いた長いRNAフラグメントの合成は配列依存性が高いと言えます。これは、二次構造の形成の可能性によるためと、RNAの2′-OH反応基の付加に対する化学合成の固有の困難性があり、合成にかなりの複雑性をもたらすためである。一般的に合成化学的RNA合成法では、300塩基程度の長鎖RNAオリゴを合成することしかできません。同社は、SP6やT7ポリメラーゼを使用してインビトロでのRNA製造プロセスを最適化する方法を用いて、3000塩基を超える数千の長鎖RNA転写産物を合成するという挑戦をしてきました。

すべてのRNA転写産物は、使用する試薬から、オリゴヌクレオチドからDNAテンプレートの製造に至るまで、厳しい品質管理システム下で生産されます。各ステップは、質量分析、アガロースサイズチェック、複数箇所での双方向DNAシーケンシングによってスクリーニングされます。転写後、RNAを変性PAGE電気泳動、リアルタイムPCR、その他ご希望のカスタムアッセイで慎重にチェックします。万が一、受注後30日以内に製品に問題が発覚した場合、喜んでお客様のオリゴを無料でリメイクします。すべての注文には、分析証明書が同梱されています。

4. IVT RNAの用途

以下のような様々な分子生物学的用途に使用可能です:

Real-Time PCR用RNAコントロールテンプレート
アンチセンス技術
ハウスキーピング遺伝子の内在性コントロール
外部RNA spike-inコントロールアッセイ
in-situハイブリダイゼーションRNAプローブ
アンチセンスRNAによる発現制御
インビトロ翻訳のための鋳型RNA
RNA構造研究 (タンパク質-RNAの結合)
リボザイム生化学
アプタマーの発見 (SELEX)

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Supplied by Bio-Synthesis