ペプチド シーケンシング受託サービス

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バイオシンセシス社による正確で信頼性の高い特性評価と同定を行うペプチドシーケンス(タンパク質シークエンス)サービスをお届けします。

目次

• サービス概要
• 参考料金
• サンプルについて

ペプチドシーケンス: エドマン法によるガスフェースアミノ酸一次構造解析受託サービス

タンパク質の同定には、酵素消化によるペプチドの質量分析が一般的ですが、エドマンシーケンシング (N-末端配列決定)は、自動化された気相配列決定 (GPS)としても知られており、質量分析法では得られない追加データを提供します。GPS (Gas Phase Sequencing)は、未知のタンパク質の同定だけでなく、リコンビナントタンパク質の品質チェックや酵素切断部位の特定にも使用されます。GPSは、創薬のあらゆる段階で使用される強力な補完技術です。

シーケンシングサービスの概要

• N末解析
• 数ピコモル程度の高感度解析能力
• N末7-20残基の解析
• サンプルは溶液、PVDF転写膜、A.Aゲル
• 7-14日での結果報告

サービスと参考価格

タンパク質によっては、アセチル化やピログルタミン酸などのブロッキング基によってN末端が修飾されているものがあり、エドマン分解による標準的なN末端配列のシーケンシングがうまくいかないことがあります。別途セットアップ料を申し受けます。

主な使用機器

• Applied Biosystems 494 Procies High-Throughput Protein Sequencer
• Applied Biosystems 494 cLC 高感度プロテインシーケンサー
• 日立 L-8800 生理食塩水用アミノ酸分析装置
• 島津製作所HPLCシステム など

ご提出頂くサンプルについて

Preparation | Amount | Condition | Format | ご注意 | Loading | Tips

輸送時のダメージから守るため緩衝材を使用し、液体サンプルの場合、スクリューキャップ (ガスケット付き)のエッペンドルフチューブに入れてお送り頂くことをお勧めします。ガスケット付きチューブを使用できない場合は、Parafilmを使用してキャップが輸送時に外れないようにしてください。サンプルの冷蔵如何は、お客様の裁量に委ねられます。
PVDF膜上にあるサンプルは、冷蔵の必要はないと考えられます。レターパックなどで、2枚の清潔な濾紙の間にして乾燥膜を送ることを推奨します。PVDF膜の個々のスライスを送ることをお勧めします。また、配列するバンドを示す膜のプリント (またはスケッチ)も含めてください。

◆サンプル前処理

適切なサンプル前処理が最適なタンパク質シーケンス結果につながります。「標的」の配列が他の配列の存在によって不明瞭になる可能性があり、有用なデータを生成することがより困難になります。従って、1つの重要なパラメーターは他のタンパク質によるコンタミであると言えます。濃度、サンプルの量、界面活性剤、グリセロール、バッファー、その他の塩の存在と濃度などの追加の考慮事項もシーケンシングの結果に影響を与える可能性がありますので、サンプルを送付前に遠慮なくご相談ください。

◆サンプル必要量

• ペプチド/タンパク質
  1. N末端エドマン配列決定: 5〜50 pmol (実績としては1 pmol程度の少量精製タンパク質でデータが得られている)
  2. 内部エドマン配列決定: 5〜100 pmol (試料の分子量に応じて1〜5 μg)
• ゲルサンプル: >50 picomoles (またはクリーンアップが必要な場合、目的のタンパク質バンドを視覚的に識別できる場合)
  注：内部配列決定サンプルには適切なブランク (ネガティブコントロール)が必要です。

◆サンプル条件

• N末端配列分析の場合:
  1. PVDF: 後述の方法で染色し、ドライメンブレンとして提出。
  2. 溶液: 100マイクロリットル以下、塩成分の少ない揮発性のバッファー。
• 内部配列分析の場合:
  1. PVDF: 後述のように染色し、乾燥した状態で提出します。サンプル量の実用上の最大限度は、ミニゲル上で約20レーンです。できるだけ少ないレーン数にサンプルを濃縮すると、最良の結果が得られます。
  2. ゲル: ゲルサンプルはミニゲルの1～3レーン (厚さ1mm以下)に限定し、0.5%クーマシーブルーでのみ染色することができます。
  3. G-250: ご相談ください。
  4. ニトロセルロース: ペプチドの回収率が低いため、推奨しません。

注: サンプルは1.5 mlポリプロピレン製のマイクロ遠心チューブに入れてください。

◆サンプル状態

乾燥、溶液、SDSまたは天然のポリアクリルアミドゲル片として、PVDFメンブレンにエレクトロブロット状態で、それぞれ以下をご参照ください。ニトロセルロースはエドマン化学と相容れません。

• 凍結乾燥サンプル
  特に指定のない限り、0.05%TFA/50%アセトニトリル、70%ギ酸、または100%TFAで再構成してロードします。溶解性に問題がある場合は、お問い合わせください。
• 液体サンプル
  単一のペプチドまたはタンパク質の純度が90%以上である必要があります。水、アセトニトリル、プロパノール、酢酸、ギ酸などの揮発性溶媒30～150ulに10pmol以上の純粋なタンパク質を溶解したもの。
  以下の試薬はお避け下さい:
  • バッファーと一級アミン: タンパク質の精製にはトリス緩衝液がよく使われます。SDS-PAGEから回収したサンプルにはトリスとグリシンが一般的です。
  • グリセロールとスクロース: これらの試薬は、タンパク質の保存や取り扱い用の緩衝液によく添加されます。これらの化合物は揮発性ではなく、粘性の高い残留物を残します。
  • 非イオン性界面活性剤: Triton X-100、Brij、Tween溶液には、エドマン分解を阻害するアルデヒド、酸化剤、その他の汚染物質が含まれていることが多い。
  • SDS: 大量のSDSは装置の誤作動の原因となり、フィルターからサンプルが失われる可能性があります。

  ご注意

  透析チューブには、汚染物質やその他の妨害物質が含まれていることがよくあります。透析はサンプル調製の最後のステップとしては避けるか、十分に洗浄した高品質のチューブを使用してください。
  緩衝液からこれらの物質を取り除くことができない場合はご相談ください。
  サンプル提出時にSDSゲル画像をご提出ください。

• エレクトロブロットサンプル
  Samples purified by SDS-PAGE must be electroblotted onto PVDF membrane and sequenced directly from PVDF membranes. Nitrocellulose membrane is NOT acceptable as it is not resistant to the Edman chemistry. We have recommended protocols for Electroblotting and staining available on our Electroblotting page (メーカーサイト). In general we recommend
  1. The average sequencing yield from PVDF is approximately 15% instead of the 50-80% expected for solution samples, so a 10 pmols sample on PVDF usually gives 1.5 pmols amino acid peaks. This is due to water vapor that aids PiTC coupling in the Edman chemistry being repelled by the PVDF. Therefore, our preferred stains are old-fashioned Coomassie blue and Ponceau S. or Amido black (silver stains may not be used)
  2. Destained extensively with at least 4 changes of destaining solvent.
  3. Washed with 3-4 changes of ultra-pure water to lower the very high concentrations of Tris, glycine, and other gel and transfer buffers that otherwise will interfere with sequencing.
  4. DO NOT remove all the stain from the bands, they need to be clearly visible for excision as PVDF without protein hinders the flow of chemicals thru the instrument’s sample cartridge. This sample cartridges can hold approximately 20 square mm of PVDF membrane. This is roughly equivalent to a slice 1-2 mm high and the width of three lanes of a mini-gel. We prefer that a non-glycine electroblot buffer be used. Glycine is an amino acid and will contaminate the sample resulting in uninterpretable sequence information for one or two cycles.
  5. After air drying, the bands or spots of interest should be individually excised and placed in 1.5 ml Eppendorf tubes for shipment.
• ゲルサンプル
  Gels should be stained with Coomassie Blue R-250 or G-250.Do not use silver stain.Protein can be passively eluted from polyacrylamide in an overnight procedure for an additional fee.
  Passive elution is generally less efficient than electroblotting and does not work with high mw proteins. It is recommended for well stained protein bands that are less than 60kDa.

◆Sample Loading

Your sample will be loaded into the sequencer cartridge by spotting a pure protein liquid sample onto a Biobrene-saturated glass fiber filter or by placing a small amount of PVDF membrane directly into the sample cartridge. Liquid samples that contain contaminating or comfounding chemicals (see under Liquid Samples) will be loaded onto ProSorb cartridges and washed with 0.2% TFA to remove contaminants before sequencing commences. There is an additional charge for this preparation step.

◆Tips:

1. All reagents and solvents must be of the highest purity available (HPLC grade, sequencing grade and electrophoresis grade reagents) to avoid contaminating substances. Avoid molecular biology grade reagents.
2. Always wear gloves and work in a clean dust free area. Dust and finger prints are a major source of contaminating amino acids present in sequencing samples.
3. Avoid drying the sample in glass tubes. This can lead to substantial loss of sample for some proteins. Sample volumes should be less than 150 ul, however with the advent of ABI’s Prosorb Sample Preparation Cartridge, sample volumes of up to 750 ul may be sequenced.
4. The sample should be in a volatile solvent or buffer such as acetic acid, formic acid, trifluoroacetic acid, triethylamine, pyridine, acetonitrile, propanol, water, or ammonium bicarbonate (if lyophilized repeatedly).
5. A minimum of 10 to 50 pmol of sample should be analyzed. Our Precise sequencer can sequence 1-2 pmol of sample at its highest level of sensitivity. However, it is more practical to sequence larger amounts of protein to be confident of the sequence obtained or to be confident that the N-terminus is blocked if no sequence is obtained. In most cases the amount of sequence able material is underestimated by sample loss, inaccurate quantitation, or N-terminal blockage during sample preparation. Therefore, be sure to err on the side of too much sample rather than too little!
6. The sample may contain a small amount of detergent (less than 0.1% SDS). Larger amounts can cause instrument problems.
   When submitting electroblotted samples on PVDF for sequencing, always try to have as much protein as you can in as small an area of PVDF as possible. Too much PVDF in the sequencer’s reaction cartridge can lead to excessive sequencer background.
7. One reason why the initial yields are often unexpectedly low, is that the amount of sample present is overestimated by the investigator. The most reliable quantitation method is from amino acid analysis. Lowry, BCA, dye binding assays and absorbance are less accurate methods especially in the low microgram amounts.

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