親和性成熟や抗体安定性改善などの抗体操作

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目次

抗体の様々な処理 ･ 操作が可能

バイオロジカがお届けするCreative Biolabs社による抗体の各種加工には、抗体の親和性成熟 (Affinity Maturation)、抗体安定性改善、キメラ抗原受容体 (CAR)構築、scFv/Fab構築を含め、その他の抗体特別化 ･ 修飾サービスが含まれます。

最初のハイブリドーマが得られると、その機能性を高めるために抗体を改変する可能性が生じます。
すでに抗体は、癌や自己免疫疾患を含むいくつかの疾患症状を治療するための新薬の主要クラスとなっております。多くの診断薬 ･ 治療薬の基礎として、抗体の特異的抗原結合能力は、様々な目的にとって重要です (例. 検出限界の拡大、解離半減期の延長、用量の減少、効力の増加など)。従って、これらの抗体または抗体関連分子をそれらの活性を改善することは依然として有益といえます。

最新の分子生物学的技術を通じて、関心のある抗体を用途に合うように修飾 ･ 加工することができます。重鎖および軽鎖配列が決定されている場合、その興味のある抗体は、異なるアイソタイプか様々なフォーマット (例. scFv、Fab、sdAb、二重特異性抗体など)に再構成されます。また、アフィニティー測定、ヒト化、カニオン化等々を含む修飾に再構成されます。その1つの方法としては、抗体の関心領域をシーケンシングおよびクローニングし、この選択領域を適切なフレームワークに移植してプラスミドを構築することによって行われます。次いで、予測された抗体は、哺乳類細胞およびE. coli株のような適切な発現系を用いた一過性トランスフェクションによって産生され得ます。選択肢として、抗体修飾には、非常に広い候補を得るためにファージディスプレイまたは他のディスプレイ方法を組み込むことができ、または多数の用途に最も理想的な製品を選択することもできます。同社は、10年以上にわたって抗体工学の分野に専念し、さまざまな抗体エンジニアリングサービスを統合、包括的なプラットフォームを確立しました。

antibody engineering

抗体親和性の成熟

親和性成熟は、抗原に対する抗体親和性を改善するプロセスです。In vivoで免疫系による天然の親和性成熟は、体細胞超変異およびクローン選択によって得られます。In vitroの実験室親和性成熟においては、突然変異および選択によって得ることができます。

同社は通常、親和性成熟における抗体フォーマットとしてscFvを使用します。また、抗原結合スクリーニング中のアビディティー効果を減少させるために、一価ディスプレイファージミドシステムが使用されます。また、VHH (シングルドメイン抗体)に対する親和性成熟化サービスも提供できます。非標的突然変異誘発およびオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発の2つの方法を用いて、オリジナル抗体の多数の突然変異体を導入するためのランダムあるいは決まったサブライブラリーを構築します。次いで、スクリーニングの厳密性を増加させることで、より高い親和性の抗体バインダーが選択されます。scFv/Fab抗体の一連のサブライブラリーを構築することにより、同社独自のプロトコールで、scFv抗体の親和性を10-9から10-10まで高めることができます。10-12の極めて高い親和性を有するscFv抗体を得ることにも成功しております。

Untargeted Mutagenesis

抗体親和性成熟
サブライブラリー構築中に主にCDR領域を変異させるために、error-prone PCRに組み込まれたDNAシャッフリング法を使用します。フレームワーク位置に免疫原性の突然変異を導入する可能性が懸念されない場合は通常、このアプローチを用いて、VHおよびVL断片全体にわたって完全にランダムな位置に突然変異を起こします。このような場合、サブライブラリーの遺伝的多様性は、同社独自のバクテリア突然変異株”CD-affiTM“を経由することによってさらに増加します。

Oligonucleotide-directed Mutagenesis

抗体 ･ 抗原複合体の構造が利用可能または抗体 ･ 抗原の構造をモデリングすることが可能である場合、特定の位置は、決まった多様性で無作為化され、親和性を改善します。例えば、20アミノ酸全てでの完全無作為化、または選んだアミノ酸で固定パーセンテージで偏った無作為化されます。また、三量体コドン技術を用いて決まった突然変異を組み込むために任意のサブライブラリーを作製することができます。ほとんどの場合、(生殖細胞系列および抗体サブファミリー配列と比較して)保存配列を見出すために、抗体のアミノ酸配列を調べる必要があります。次に、保存されていないフレームワーク領域の位置に突然変異を導入することができます。おそらく、これらの領域は抗原特異的であり、これらの領域の変化は免疫原性を増加させないと思われます。

Phage Display Antibody Library Screening

その後のライブラリースクリーニングでは、高い親和性を有する抗体突然変異体を釣り上げます。2つのライブラリースクリーニング戦略が利用可能です。最初の”surface-panning”戦略では、抗原の濃度減少は表面固定化されます。溶液中の標識された抗原が使用される第2の”solution-sorting”戦略では、平衡定数 (Kd)に基づく選択と結合キネティクスに基づく選択という2つのアプローチがあります。第1のアプローチでは、サブライブラリーファージを、制御された濃度でビオチン化抗原と共にインキュベートし、結合したファージを固定化NeutrAvidinによって捕捉します。第2のアプローチは結合キネティクスに基づく選択です。これはoff-rate (Koff)選択とも呼ばれ、制御された時間の間、大きなモル過剰の非標識抗原が混合物に添加される前に、ファージ集団が標識抗原を飽和させます。これにより、off-rate (Koff)が遅い突然変異体抗体の選択が可能になります。Koffの減少は通常、より高い親和性をもたらすので、この選択アプローチで、改善されたKdを有する抗体変異体を選別します。

詳しくはこちらもご覧ください。

Antibody Affinity Measurement

抗体の結合動態解析には”Biacore Analysis”サービスを提供しています。通常、チップ上の抗体を捕捉し、捕捉された抗体の上に抗原を流します。抗原は各抗体について6つの異なる濃度で測定され、それぞれの抗原濃度から得られる結合定数に対してカイ二乗分析を行います。ドキュメンテーションパッケージには、リアルタイムオンレート (Ka)、オフレート (Kd)、親和定数 (KD)、カイ二乗値およびリアルタイム結合キネティクスのグラフが含まれます。約50μLの1mg/mLの抗原および抗体溶液が必要です。また、〜100ugの抗原と〜50ugの抗体が必要です。抗原についての分子量情報も必要となります。反復または複数のエピトープを有する抗原について特別な考慮が必要な場合があります。>> 抗体アフィニティー測定サービスの詳細はこちらのメーカーサイトをご覧ください。

Peptide Affinity Maturation

アラニンスキャニング突然変異誘発は、ペプチドバインダーの親和性成熟における同社の得意とする方法です。この方法では、選択された結合ペプチドの各単一アミノ酸がアラニンで置換され、次いで、修飾ペプチドの標的タンパク質への結合がBiacore技術を用いてアッセイされます。非必須アミノ酸が具体的に同定されます。その後、非必須アミノ酸の位置にランダム配列を含むdirected/constrainedペプチドサブライブラリを作製します。ここでもまた、”NNK”または”三量体コドン”戦略を使用して、非必須残基を無作為化します。増加した結合親和性を有する突然変異体は、スクリーニングの厳密性を増強することとファージELISAにより同定されます。

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